Genomica e Proteomica

L’Area di ricerca genomica e proteomica riguarda attività basate sull’indagine molecolare dei trascritti e delle proteine espresse in un comparto cellulare. Essa è basata sulla separazione di centinaia di prodotti proteici, sulla quantizzazione di prodotti d’espressione specifici, e sulla ricerca dei meccanismi alla base di processi biologici includendo sia ricerche a carattere metodologico che tecnologico. Quest’area è altamente multidisciplinare e richiede l’integrazione di conoscenze biochimiche, bioanalitiche, bioinformatiche e biomolecolari. Le ricerche riguardano la definizione di prodotti d’espressione candidati e le proteine espresse in specifici comparti cellulari avvalendosi di modelli umani ed animali. Tale studio globale è finalizzato alla comprensione dei meccanismi biologici in particolari condizione fisiologiche e patologiche a carico degli organi in esame. L’obiettivo è l’identificazione dei targets molecolari coinvolti e la comprensione dei meccanismi sottesi all’adattamento o alla progressione della malattia. Lo studio proteomico richiede il continuo sviluppo di metodi per il miglioramento delle capacità separative, della sensibilità e delle possibilità di interpretazione dei dati correlati ai segnali biologici. I risultati delle ricerche sono: nuovi targets e nuove metodologie. L’Area Genomica e Proteomica si sviluppa in tre linee di ricerca principali, che riguardano rispettivamente: la proteomica sistematica, la proteomica differenziale, lo sviluppo di nuove metodologie separative.

La proteomica sistematica prevede l’identificazione delle proteine maggiormente espresse in un tessuto e la costruzione di data base.

In quest’area si colloca il seguente progetto:

2.3.1.1

Costruzione di mappe di riferimento delle proteine espresse in tessuti umani e animali

Descrizione:	Le proteine estratte vengono separate in gels bidimensionali. Il risultato produce un immagine con centinaia di macchie che indicano polipeptidi con un preciso punto isoelettrico e massa molecolare approssimata. Le macchie sono estratte dal gel ed analizzate in spettrometria di massa. L’analisi in massa e la ricerca in data-base specifici permette l’identificazione di ciascuna macchia alla quale viene assegnato un numero di identificazione fornito dalla banca dati SwissProt. Il database 2D ottenuto permette la costruzione di mappe di riferimento che rappresentano il punto di partenza degli studi di espressione differenzale e sono stati applicati al muscolo scheletrico umano, al soleo di ratto e alla retina di topo.
Partecipanti:	C. Gelfi, S. De Palma, A. Viganò, A. Pontoglio, D. Capitanio, S. Bertuzzi, M. Ripamonti, R. Bottinelli, P. Cerretelli, R. Wait
Collaborazioni:	Cattedra di Fisiologia, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi, Milano Dipartimento di Fisiologia, Università degli Studi, Pavia Fondazione Telethon Dipartimento di Reumatologia Imperial College, Londra.
	Pubblicazioni

2.3.2

Proteomica differenziale

La proteomica differenziale prevede la quantizzazione delle proteine differenzialmente espresse e l’dentificazione delle molecole coinvolte nei processi fisiologici e fisiopatologici.

In quest’area si collocano i seguenti progetti:

2.3.2.1

Identificazione delle proteine differenzialmente espresse in seguito a patologie (studi sull’uomo)

Descrizione:	Il progetto intende chiarire, attraverso l’utilizzazione di strategie separative opportune, i meccanismi di insorgenza di alcune patologie e/o gli effetti prodotti da particolari condizioni fisiopatologiche. Lo studio prevede la quantizzazione dei profili di espressione proteica globale al fine di identificare le macromolecole coinvolte.
Partecipanti:	C. Gelfi, A. Viganò, S. de Palma, M. Ripamonti, A. Pontoglio, I. Eberini, D. Capitanio, G. Lanfranchi, E. Ricci, R. Wait, R. Bottinell, P. Cerretelli.
Collaborazioni:	Cattedra di Fisiologia, Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi, Milano Dipartimento di Fisiologia, Università di Pavia Dipartimento di Farmacologia, Facoltà di Farmacia, Milano Policlinico A. Gemelli, Università Cattolica di Roma CRIBI, Università degli Studi, Padova Dipartimento di Reumatologia, Imperial College, Londra.

2.3.2.1.1

Correlazione di espressione proteica con profili di espressione genica

Descrizione:	Al fine di identificare i meccanismi molecolari sottesi a condizioni patologiche o fisiopatologiche, le proteine differenzialmente espresse sono correlate con i livelli di messaggero corrispondenti, tramite RT-PCR e quantizzazione in fase libera in CZE a doppio raggio laser.
Partecipanti:	M. Ripamonti, C. Gelfi.
	Pubblicazioni

2.3.2.2

Studio proteomico associato a PET a guida metabolica per l’identificazione di biomarkers e nuovi targets nella diagnosi e terapia dei tumori

Descrizione:

Dopo il completamento del progetto genoma umano è emersa la staticità delle informazioni generate dal solo studio dei geni che non fornisce informazioni sulla loro funzione e, nel caso del cancro, non è in grado di predirre l’insorgenza della malattia. La ricerca basata sui profili di espressione genica è di grande aiuto per fornirci le informazioni relative al cambiamento di espressione globale indotto da un evento canceroso essa purtroppo non è in grado di fornirci le informazioni riguardanti le modificazioni posttraduzionali che avvengono a livello proteico e che sono spesso responsabili dei segnali iniziali di insorgenza della malattia. Tali tipi di informazioni sono ottenibili solo tramite uno studio dell’espressione proteica globale. In campo oncologico l’indagine proteomica delle trasformazioni di una cellula da normale a cancerogena contribuirà ad identificare molecole specifiche correlate alla malattia, permettendo di valutare l’andamento terapeutico e di individuare nuovi targets per il trattamento.
Il presente progetto si propone di combinare: lo studio proteomico d’espressione con le tecnologie diagnostiche per immagini avanzate come la PET a guida metabolica e con le nuove tecniche di terapia radiochirurgica come la Tomoterapia.
Lo scopo è l’identificazione di nuovi markers metabolici per la diagnosi e il followup di pazienti oncologici da affiancare a quelli ad oggi utilizzati (FDG e Colina) al fine incrementare la precisione della diagnosi, di predirre e predisporre una terapia adeguata.

Partecipanti:

C. Gelfi, M. Ripamonti, A. Viganò, S. De Palma, A. Pontoglio, D. Capitanio, M. Moriggi.

2.3.2.3

Identificazione di proteine espresse nel differenziamento di cellule di cartilagine e muscolo scheletrico e regolate nei due sistemi da agenti infiammatori - antiinfiammatori

Descrizione:	Mediante colture cellulari abbiamo osservato la presenza di proteine correlate allo stress cellulare espresse durante il differenziamento di cartilagine e muscolo (sistemi animali di pollo e di topo). Colture di cellule precondrogeniche portate a differenziamento terminale e colture di mioblasti portati a differenziare a miotubi capaci di contrarsi in vitro verranno impiegate per identificare proteine specificamente espresse in cellule terminalmente differenziate. Colture di cellule di cartilagine e muscolo stimolate con agenti infiammatori (LPS, IL6, IL1) ed antiinfiammatori (diclofenac, indometacina, diacereina) verranno impiegate per identificare proteine modulate in condizioni di stress cellulare. Colture di cellule da cartilagine articolare umana normale e patologica verranno impiegate per identificare proteine espresse nelle due condizioni. Stimolazione con agenti infiammatori-antiinfiammatori permetterà di identificare le proteine modulate da tali agenti. Colture di cellule staminali/progenitrici mesenchimali indotte a differenziare nei tre lineage condrogenico, osteogenico, adipogenico verranno impiegate per identificare proteine specificamente espresse nelle tre condizioni.
Partecipanti:	F. Descalzi, V. Ulivi, A. Pianezzi, L. Camardella, R. Cancedda
Collaborazioni:	IST, Genova; Università di Genova IBPE, CNR, Napoli
	Pubblicazioni

2.3.3

Nuove metodologie separative

Quest’area comprende lo sviluppo di nuove metodologie per la caratterizzazione di molecole biologicamente attive, come peptidi e proteine, utilizzando sistemi ad alta risoluzione.

In quest’area si collocano i seguenti progetti:

2.3.3.1

Sviluppo di nuove colonne capillari per la separazione in fase libera di peptidi e proteine

Descrizione:	Il progetto si prefigge lo sviluppo di sistemi di neutralizzazione della parete di colonne capillari per elettroforeasi zonale (CZE). Il loro sviluppo si inserisce nell’area delle nuove metodologie legate alla proteomica il cui sviluppo permetterà la separazione di peptidi e proteine a basso peso molecolare tramite elettroforesi in fase libera e si pone come alternativa ai metodi di separazione classici.
Partecipanti:	C. Gelfi, A. Viganò, M. Ripamonti, A. Pontoglio, A. Citterio, R. Sebastiano, PG. Righetti.
Collaborazioni:	Dipartimento di Chimica dei Polimeri Politecnico, Milano Università degli Studi, Verona
	Pubblicazioni

2.3.3.2

Sviluppo di nuove metodologie di separazione di digeriti triptici di miosine umane e quantizzazione in CZE

Descrizione:	Gli studi proteomici si basano generalmente sull’analisi bidimensionale. Nonostante il mezzo sia estremamente potente e riproducibile presenta notevoli limiti per le proteine a basso e ad alto peso molecolare che per diverse ragioni vengono perdute nella mappa. Lo sviluppo di metodi per l’analisi in fase libera di proteine ad alto e basso peso molecolare come peptidi biologicamente attivi, permetterà di allargare lo studio proteomico. Le macromolecole in esame verranno digerite , marcate con fluorofori specifici e separate in elettroforesi capillare. L’uso della CZE a doppio raggio laser permetterà la loro quantizzazione differenziale.
Partecipanti:	C. Gelfi, M. Ripamonti, A. Pontoglio, A. Viganò, S. De Palma, D. Capitanio, R. Bottinelli, P. Cerretelli, A. Citterio, R. Sebastiano, PG. Righetti, A. Arnoldi.
Collaborazioni:	Cattedra di Fisiologia Dipartimento di Scienze e Tecnologie Biomediche, Università degli Studi, Milano Dipartimento di Fisiologia, Università degli Studi, Pavia Dipartimento di Chimica dei Polimeri Politecnico, Milano Università degli Studi, Verona DISMA, Università degli Studi, Milano
	Pubblicazioni

Obiettivo Generale

Tematiche di ricerca istituzionali